膜分離技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用

 

    隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，由發(fā)酵法生產(chǎn)的微生物藥物的分離和純化正面臨著一系列新的問題，如含量低 、活性高、易失活、提取收率低等。膜分離過程作為一種新型的分離 技術(shù)，在現(xiàn)代生物制藥分離工程中具有巨大的應(yīng)用潛力，得到了廣泛的發(fā)展，已經(jīng)用于酶、活性蛋白、氨基酸、維生素、甾體 、疫苗等物質(zhì)的分離純化，而膜分離技術(shù)在抗生素提煉中的應(yīng)用也是重點推廣的領(lǐng)域之一[1]。 
   成功的生物制品的商業(yè)化生產(chǎn)需要經(jīng)濟而又高選擇性的分離方法。處理過程視產(chǎn)品價格、生產(chǎn)規(guī)模而變化，而各種藥物生產(chǎn)過程中所處理的對象很不相同，例如微粒大小、不純潔度、所需終產(chǎn)品濃度也并不一樣。為避免價格昂貴的 色譜分離和熱分離方法，選擇新的分離固液混合物的分離系統(tǒng)的研究就顯得十分重要[2] 
。 
多數(shù)抗生素的分子量在300—1200范圍，存在于胞外，從發(fā)酵液中提取。傳統(tǒng)提取方法主要有：吸附法、溶劑萃取法、離子交換法和沉淀法。各種方法各有特點，但工藝往往都十分繁雜，所需時間長，易變性失活，需消耗大量的原料、能耗高、回收率低 、廢水污染嚴(yán)重且處理難度大。膜分離過程作為一門新型的分離、濃縮、提純及凈化技術(shù)，具有節(jié)能，不破壞產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、少污染和操 作簡單、可在常溫下連續(xù)操作、可直接放大、可專一配膜等特點，且各種膜過程具有不同分離機制，適于不同對象和要求[3]。由于其特別適合用于熱敏性物質(zhì)的分離，在食品加工、醫(yī)藥等領(lǐng)域有其獨特的實用性。用于微生物藥物分離和純化中的膜分離技術(shù)主要涉及微濾 、超濾、納濾 、液膜分離和反滲透等。 
1 膜分離技術(shù)在抗生素、氨基酸和酶類分離純化中的應(yīng)用 
1.1 膜分離技術(shù)的特點 
傳統(tǒng)抗生素提煉工藝；發(fā)酵液→過濾或離心或大孔樹脂吸附、萃取→濃縮→脫色→干燥→產(chǎn)品。 
采用膜分離技術(shù)工藝可簡化為：發(fā)酵液→超濾→納濾(或反滲透)→脫色→干燥→產(chǎn)品。  
相對于傳統(tǒng)工藝，膜分離具有以下優(yōu)點：大大簡化了工藝，一次性投資少 ，維護(hù) 、操作簡單，運行費用低 ，節(jié)省資源 ；運行無相變不破壞產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，分離效率高，提高了產(chǎn)品的收率和質(zhì)量；不需要溶劑或溶劑用量大大減少，因此廢水也更易處理。 
1.2 分離原理 
    根據(jù)截留組分的不同，可以將膜過程分為微濾、超濾、納濾、反滲透、滲透蒸發(fā)、滲析、電滲析、氣體分離等。用于發(fā)酵液后處理的膜技術(shù)主要是超濾，其次是納濾、微濾、反滲透以及液膜分離等 。 
    (1)微濾膜是利用篩分原理，分離截留直徑0．O1～10µm以上的粒子，如發(fā)酵液中的菌體、細(xì)胞、不溶物等。微溶主要應(yīng)用于細(xì)胞收集。液固分離等方面，常作超濾的預(yù)處理過程； 
    (2)超濾膜屬于非對稱多孔膜，孔徑在 2～50nm，利用高分子薄膜選擇滲透性，在常溫下依靠一定的壓差和流速，使小于膜孔徑的低分子量物質(zhì)透過膜而使高分子物質(zhì)被截留。已開發(fā)具有不同分子截留的各種超濾膜 (1000～100萬 分子量 )，它可按分子大小選擇膜孔徑，處理發(fā)酵液可以截留病毒、蛋白質(zhì) 、酶、

 
3 
多糖等大分子物質(zhì)，對目的產(chǎn)物進(jìn)行純化； 
    (3)反滲透的分離基本原理是溶解擴散學(xué)說，主要應(yīng)用于小分子有機物的濃縮 ，只允許溶劑分子通過，鹽、氨基酸等小分子被截留； 
    (4)納濾膜平均孔徑 2nm 左右，處理發(fā)酵液時截留組分可小到抗生素，合成藥、染料、雙糖等，允許水、無機鹽、有機物等小分子物質(zhì)通過，截留性能介于超濾和反滲透之間，對目的產(chǎn)物起濃縮作用，由于其操作壓力低，對一 、二 價離子有不同選擇性，對小分子有機物有較高的截留性等特點，加之膜表面具負(fù)電性，抗水垢污染，發(fā)展較快[4]； 
(5)液膜萃取是將膜展開成膜相，隔開另兩個液相，利用液膜的選擇透過性 ，實現(xiàn)物質(zhì)分離。實質(zhì)上是萃取與反萃取的結(jié)合。液膜法具有操作簡便，分離和濃縮能 同時進(jìn)行等優(yōu)點。但原料復(fù)雜、膜流動載體單一、膜溶脹、穩(wěn)定性、破裂、堵塞等也是該技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。液膜是一種均質(zhì)膜，其中一種形式 為乳狀液膜 ，以表面活性劑穩(wěn)定薄膜，傳質(zhì)速率快、分離效率高、選擇性好、節(jié)能，近幾年來在生物活性物質(zhì)的分離提取方面受到廣泛的重視。液膜萃取技術(shù)在抗生素提煉中的應(yīng)用報道有青霉素、紅霉素的提取[5]。 
1.3 膜分離技術(shù)在抗生素、氨基酸和酶類微生物藥物分離純化中的應(yīng)用 
表1分別介紹了微濾、超濾、納濾、反滲透、液膜分離等五種方法在B一內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等抗生素以及氨基酸和酶類微生物藥物分離純化中的應(yīng)用。 
 
表1    膜分離在抗生素、氨基酸和酶類微生物藥物分離純化中的應(yīng)用 
 2 分離純化的方式方法 
    根據(jù)近年來國內(nèi)外應(yīng)用膜分離純化微生物藥物的方式方法，大致有以下幾類 。 
2.1 分離方式 
    對于納濾，可以用以下兩種方式對原有抗生素提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，一是用溶劑萃取抗生素后，萃取液用疏水性納濾膜處理，濃縮抗生素。可改善操作環(huán)境；二是用親水性納濾膜對未經(jīng)萃取的抗生素發(fā)酵濾液進(jìn)行濃縮。除去水和無機鹽，再用萃取劑萃取，可大幅度提高萃取過程的生產(chǎn)能力，減少萃取劑的用量。 
2.2 多層液膜分離 
例如紅霉素在水／油乳狀液滴中的滲透，乳狀液滴中一旦形成的濃團(tuán)，會使分離性能降低。為防止這種情況發(fā)生，料液和乳狀液應(yīng)分別為分散相和連續(xù)相 (噴霧柱式 接觸器中)見 圖 1。經(jīng)過一系列的間歇式和連續(xù)式操作，紅霉素透過膜相，在抽提相中濃縮 。

 
5 
膜相，在抽提相中濃縮 。 
 
 
圖1  紅霉素在噴霧柱式接觸器中水/油乳狀液滴滲透的示意圖[9] 
 
    一般選擇低分配系數(shù)的油相，因為這樣透過率相對低，料液相液滴分散在乳狀液滴膜相中。溶質(zhì) 的滲 透可以從兩個路徑進(jìn)行：①膜相分離系數(shù)高，溶質(zhì)直接擴散到膜相中的各個抽提相液滴當(dāng)中；②膜相分離系數(shù)低，溶質(zhì)從料液相一步步傳送到乳狀液滴中，再傳到乳狀液滴表面的抽提相中。這樣，可以得到更高的分離效果，同時乳狀液膜相穩(wěn)定性也提 高了[9]。 
2.3 組合分離 
    抗生素發(fā)酵液的分離有時候需要1～3個的膜分離操作。第一步固液分離通常應(yīng)用微濾或超濾，分離得含抗生素 ，鹽 和水 的透過 液。透過液的質(zhì)量決定后序方法的選擇，有時需再一次用到超濾，之后用納濾濃縮 。是否需要中間凈化取決于濃縮抗生素的溶劑萃取結(jié)果，如果只用了一次超濾、納濾后萃取結(jié)果滿 意，就不需中間凈化了，否則還需要一中間次凈化[10]。 
(1)超濾和納濾膜組合分離6一氨基青霉烷酸 (6一APA)，是生產(chǎn)半合成青霉素的關(guān)鍵原料。何旭敏等[11]用超濾膜處理6-APA 的鉀鹽 ，經(jīng)反應(yīng)罐中裂解后，在一定溫度下，用3mol/I氨水 調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH=7.5～8.8至裂解完全，再經(jīng)納濾膜濃縮，裂解率為97.5% 。 
(2)超濾、納濾和轉(zhuǎn)相組合分離劉路等[12]應(yīng)用超濾、納濾和轉(zhuǎn)相組合分離技術(shù)，純化、濃縮林可霉素發(fā)酵液，縮短并優(yōu)化了傳統(tǒng)工藝路線，大大節(jié)省溶劑和能源，提高了收率及質(zhì)量。平板超濾器截留固體顆粒及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，但對林可霉素、Fe3+、Na +等小分子無截留作用，超濾只起凈化作用。第二步用平板納濾器，壓力為2．9～3．0MPa，進(jìn)液溫度12.5℃下，截留鐵鈉離子，濃縮倍數(shù)達(dá)10倍以上。濃縮液經(jīng)轉(zhuǎn)相，減壓濃縮、加酸、即可結(jié)晶得粗粉，所得晶粒大而均勻，色級比原來淡，質(zhì)量得到控制，提高了收率。該技術(shù)另一個重要意義，是解決了污水治理問題 ，省去了回收溶劑過程，僅在轉(zhuǎn)相時產(chǎn)生小量的污

 
6 
水。 
(3)超濾和反滲透膜組合分離李十中等[13]先用截留分子量5萬的超濾膜處理土霉素結(jié)晶母液，除去母液中的懸浮物和大分子物質(zhì)。然后反滲透膜處理，這一步脫鹽率可達(dá)99 %。所得濃縮液，再經(jīng)截留分子量為1萬的超濾膜，體積濃縮10倍，*后調(diào)pH值從土霉素結(jié)晶母液回收土霉素，得到土霉素的純度82.9% ，效價771u／mg，回收率62% 。 
2.4 膜分離技術(shù)與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相結(jié)合 
膜分離技術(shù)與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展出了一些全新的膜分離過程，在 不同程上吸取了膜分離和傳統(tǒng)分離方法的優(yōu)點而避免了兩者原有的缺點，是膜 技術(shù)發(fā)展的主要方向。李十中等[14]利用超濾/萃取法提取青霉素G、紅霉素和麥 迪霉素，通過比較，發(fā)現(xiàn)新工藝收率和質(zhì)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的萃取法，而且不需要加破乳劑，靜置分層快，不需要離心分離或活性炭脫色。可以看出這種結(jié)合在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用前景是令人鼓舞的 。 
2.5 膜過濾裝置的選擇 
膜過濾組件大致可分為四種型式：即管式、中空纖維式、螺旋卷繞式和平板式，各種型式組件的性能比較見表2。 
 
表2 各種超濾器性能的比較

板式和管式多用于小批量的濃縮生產(chǎn)，卷式和中空纖維組件由于填充密度 
高 ，易規(guī)模化生產(chǎn)，造價低，可大規(guī)模應(yīng)用[1]。 
超濾過程的操作方式超濾系統(tǒng)可以采用間歇操作或連續(xù)操作。連續(xù)操作的優(yōu)點是產(chǎn)品在系統(tǒng)中停留時間短，這對熱敏或剪切力敏感的產(chǎn)品有利，主要用于大規(guī)模生產(chǎn)。主要缺點是在較高濃度下操作，故通量較低。間歇操作平均通量較高，

 
7 
所需膜面積較小，裝置簡單，成本也較低，主要缺點是需要較大的儲槽。 
3 面臨問題、解決方法和發(fā)展方向 
3.1 面臨問題 
    (1)濃差極化  濃差極化是指分離過程中，料液在壓力驅(qū)動下透過膜，溶質(zhì)被截留，于是在膜與本體溶液界面或膜界面區(qū)域濃度越來越高，引起滲透壓增大，在膜表面形成沉積或凝膠層，增加透過阻力，改變膜的分離特性，使膜發(fā)生溶 脹或惡化膜的性能，導(dǎo)致結(jié)晶析出，阻塞流道[1]。 
    (2)膜污染  膜污染是指處理物料中的微粒、膠體粒子或溶質(zhì)分子與膜發(fā)生物理化學(xué)相互作用或因濃度極化使某些溶質(zhì)在膜表面濃度超過其溶解度及機械作用而引起的在膜表面或膜孔內(nèi)吸附、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產(chǎn)生透 
過流量與分離特性的不可逆變化現(xiàn)象[1]
。 
3.2 解決方法 
3.2.1 膜的處理 
    (1)使用復(fù)合膜  在膜上可涂上一層聚乙醇乙烯，改善親水性和膜表面的光滑度，以免膜污染和提高產(chǎn)物滲透性。Zhang等用哌嗪和 trimesoylchloride界面聚合的復(fù)合膜用于抗生素的分離，其分離效率 與商用納濾膜媲美。分別用平板式和螺旋卷式納濾膜濃縮 793.7～992.1U 的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，截留率可達(dá)99% ，濃縮倍數(shù)在實驗室為10倍左右，中試階段為4倍以上 。 
2)改變膜的表面極性和電荷  在膜制備時，改變膜的表面極性和電荷，常可減輕污染。也可將膜先用吸附力較強的溶質(zhì)吸附，如聚砜膜可用大 卵磷脂的乙醇溶液預(yù)處理，醋酸纖維膜用陽離子表面活性劑處理。輻射嫁接的方法是膜表面改 性的途徑之一。Shim等采用7一射線輻射，將親水性的甲基丙烯酸一2一羥乙酯單體嫁接到聚丙烯超濾膜表面上并用改性后聚丙烯膜對牛血清蛋白溶液進(jìn)行超濾處理。發(fā)現(xiàn)溶液通量增加膜的抗污性增強，同時膜表面的親水性增強 。    (3)無機材料膜  近幾年開發(fā)的新型制膜材料，主要有陶瓷、玻璃和金屬。 目前國內(nèi)處于實驗室研究階段。該膜突出的優(yōu)點是耐高溫耐溶劑性能好，不易老化。可再生性強、耐細(xì)菌和強度高等。有報道制備了7一氧化鋁復(fù)合膜，并在其表面形成硅烷層。改進(jìn)了膜的截留性能。無機陶瓷膜經(jīng)多年的發(fā)展，在眾多領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，成為膜領(lǐng)域發(fā)展*迅速、*有前景的品種之一。 
    (4)過程處理  抗生素的發(fā)酵液中成分比較復(fù)雜[2]，對料液進(jìn)行預(yù)處理，除去菌體，懸浮雜質(zhì)，懸浮膠體，可減少膜表面污垢附著量；另外，親水膜及膜材料的電荷與溶質(zhì)電荷相同的膜具有好的抗污性能，由于發(fā)酵液組成復(fù)雜，造成污染因素各不相同，應(yīng)在不同條件下進(jìn)行選擇。 
    膜孔徑的選擇  孔徑過大，造成孔堵塞，不僅不會得到高滲透率，還會造成膜清洗困難 ； 
    pH值的控制  溶液中pH對蛋白質(zhì)、多肽等水中的溶解性、荷電及構(gòu)型有很大影響，一般把pH調(diào)至遠(yuǎn)離其等電點，可減少膜對蛋白質(zhì)的吸附量； 
操作條件的選擇  提高膜表面上切線流速有助減緩污垢形成，通常過高切線速度增加能耗，使膜表面接觸料液濃度增加； 
    操作方式  通常采用錯流方法實現(xiàn)生物產(chǎn)品的澄清濃縮純化精制。在超濾 中增大料液流速會減少濃差極化層厚度，從而使通量增大。中空纖維超濾組件可

 
8 
采用頻繁反洗操作減緩污垢物在膜表面的富集。中空纖維微濾組件可采用吹氣人料液的方法，也可從滲透液處壓人空氣。近年，發(fā)展較快的脈沖操作方式，即在料液或滲透液頻繁改變操作壓力，頻繁流體脈沖可減緩污垢層形成，得到恒定 的高滲透率。無機鹽從二方面對膜污染產(chǎn)生重大影響 ：①無機鹽復(fù)合物會在膜表面沉積，或使膜對蛋白質(zhì)的吸附增強而污染膜；②無機鹽改變了溶液的離子強度，影響到蛋白質(zhì)溶解性、構(gòu)象和懸浮狀態(tài)，使沉積層的疏密程度改變，而影響透水率 。 
    操作溫度的選擇原則  在不影響料液和膜的穩(wěn)定性范圍內(nèi)，盡量選擇較高 的溫度，使系統(tǒng)膜通量增大。一般應(yīng)在低于1O℃下分離濃縮為好。 
   對于乳狀液膜影響條件多集中在攪拌速率、載體、表面活性劑和pH值。攪拌速率的增大，增加乳狀液滴的分散程度，乳粒變小，外相和乳粒接觸面積增大，初始提取率隨之增大；但乳粒越細(xì)越易破裂 。使已提取的青霉素又重新釋放到外相中去。載體三辛胺量大，提取率高 ；但過多的三辛胺會破壞油膜的穩(wěn)定性，反而使提取率下降。表面活性劑用量直接影響乳糜微粒的分散度和液膜的穩(wěn)定 性 ，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)運過程：用量少 。膜不穩(wěn)定易破裂，分散度小，乳粒大。提取率隨之降低；用量大，則油相黏性增強阻礙溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運，提取率也下降。在紅霉素的分離實驗中，因乳狀液滴中形成的濃團(tuán)會使分離性能降低，用噴霧柱式接觸器將料液相和乳狀液分為分散相和連續(xù)相，可得到更高的分離效果，乳狀液膜相穩(wěn)定性也提高。 
由上可以看出，適當(dāng)運用膜的各種特性，改進(jìn)膜分離性能，是其在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中的一個關(guān)鍵條件 。 3.2.2 膜清洗  
膜的長期運行中，膜污染問題必然產(chǎn)生，因此必須采取一定的清洗方式，使膜面或膜內(nèi)污染物去除，達(dá)到透水量恢復(fù)，延長膜壽命的目的。對膜清洗多見為物理法和化學(xué)法或兩者結(jié)合起來。物理清洗時借助于高流速液體流動所產(chǎn)生的機械力將膜面上的污染物沖洗掉，或海棉球機械擦洗和反洗等，其特點是簡單易行，不引入新污染物。化學(xué)清洗常用清洗劑有：酸、堿 、酶 (蛋 白酶 )、螯合 劑、表面活性劑、過氧化氫、次氯酸鹽、磷酸鹽、聚磷酸鹽等[1]。另一種是生物清洗，即借助微生物、酶等生物活性劑去除膜表面及膜內(nèi)部的污染物。后兩種清 洗都存在 向系統(tǒng)引入新污染物的可能性，運行與清洗之間的轉(zhuǎn)換步驟較多。 
3．3 發(fā) 展 方 向 
    膜分離技術(shù)與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展出了一些全新的膜分離過程。例如 ：膜蒸餾、膜萃取、膜反應(yīng)、親和膜分離等。這些新的膜過程在不同程度上吸取了膜分離和傳統(tǒng)分離方法的優(yōu)點而避免了兩者一些原有的缺點 ，是膜技術(shù)發(fā)展的主要方向。 
    膜技術(shù)現(xiàn)今的發(fā)展主要集中于高分辨應(yīng)用，包括改進(jìn)蛋白質(zhì)一病毒分離，蛋 白質(zhì)切線流分離和膜色譜。這些發(fā)展將使膜技術(shù)在生物制藥分離工程中扮演一個重要地位 。膜色譜技術(shù)已應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的下游純化過程，當(dāng)前研究膜技 術(shù)的注意力主要在保持膜分離的高通量的同時，使分離更具選擇性。所以人們對膜材料的選擇，模式，過 程設(shè)計 等更為 留心。 
4 結(jié)語 
   目前的膜分離技術(shù)在抗生素提煉過程中的應(yīng)用研究非常活躍，但實際應(yīng)用還 

 
9 
不夠廣泛。原因有：一是作為一種迅速發(fā)展起來的新型分離技術(shù)，膜分離過程本身仍存在許多技術(shù)問題有待攻克，諸如高分離因子及高滲透通量膜的制備，高穩(wěn)定性 ，耐污染清洗膜組件的研制；二是發(fā)酵液是一種復(fù)雜的介質(zhì)，黏度、濃度和顆粒大小都不一樣，甚至?xí)卸喾N與主產(chǎn)品高度相似的副產(chǎn)品，對膜分離的選擇性有很高要求：三是醫(yī)藥行業(yè)對衛(wèi)生要求極嚴(yán)，膜容易被污染；*后試驗采用的膜組件應(yīng)由自制轉(zhuǎn)向標(biāo)準(zhǔn)化，這將有利于試驗結(jié)果的可靠性的提高。膜分離技術(shù)突出的優(yōu)點和其廣闊的潛在市場使得各國研究者始終沒有停止對其進(jìn)行深入研究的步伐，展望21世紀(jì)的膜分離技術(shù)將在微生物制藥中發(fā)揮更為重要的作 用 。